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孕酮快速檢測試劑盒使用說明書
【原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孕酮和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孕酮抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孕酮的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物孕酮的含量。
【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.1ppb
檢測時(shí)間：75min
樣本定量檢測下限
組織（蝦、魚）……………………………………0.1ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 …………………………………… 1ppb
飼料………………………………………………… 4ppb
奶液…………………………………………………1ppb
交叉反應(yīng)率
孕 酮………………………………………………100%
雌二醇……………………………………………< 0.1%
雌三醇…………………………………………… < 0.1%
樣本回收率
飼 料……………………………………………90±10%
組 織……………………………………………85±10%
奶 液……………………………………………70±10%
【試劑盒組成】
1、微量測試孔：每條8孔，一板12條
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb
3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb
3、酶標(biāo)記物 12ml………………………………紅色帽
4、抗體工作液 7ml………………………………藍(lán)色帽
5、底物液 A液 7ml………………………………棕色帽
6、底物液 B液 7ml……………………………… 黑色帽
7、終 止 液 7ml……………………………… 黃色帽
8、20X濃縮洗滌液 40ml…………………………白色帽
9、2X濃縮復(fù)溶液 50ml…………………………藍(lán)色帽
【所用儀器、試劑】
儀器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl
試 劑：乙腈、正己烷、氯化鈉
【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】
配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃
縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照
1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按
所需用量配制洗滌液。
【樣本前處理步驟】
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（a）飼料樣本
1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min；
2、 取2ml上清液，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干；
3、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min，
不同樣本按如下方法稀釋：
配合料：取50µl，加入450µl稀釋后的復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。
濃縮料/預(yù)混料：取50µl，加入950µl稀釋后的復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。
配合料稀釋倍數(shù)：20
濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：40
（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）
1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入1克氯化鈉和6ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min。
2、 取3ml上清液，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。
3、 用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，
不同樣本按如下方法稀釋：
蝦魚：直接取50µl下層水相用于檢測。
豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl下層水相加入450µl稀
釋后 的復(fù)溶液，渦動混合30s；取50µl用于檢測。
樣本的稀釋倍數(shù)：
蝦魚稀釋倍數(shù)：1
豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：10
（c）牛奶高檢測限處理方法；
1、 取2ml奶液到離心管中，加入3克氯化鈉，和6ml乙氰，強(qiáng)烈振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；
2、 移取3ml上清液至干凈的試管中，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干；
3、 用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min;
4、 取50µl下層水相用于檢測分析。
樣本的稀釋倍數(shù)：1
（d）牛奶低檢測限處理方法；
1、 直接取50µl牛奶+450µl稀釋后的復(fù)溶液混合30s；
2、 取50µl用于檢測分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10
【酶標(biāo)免疫分析程序】
操作步驟：
1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
4、 加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。
【結(jié)果判定】
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含孕酮成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孕酮實(shí)際含量。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：
百分吸光度值（%） ＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孕酮濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孕酮實(shí)際含量。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線
B/B0 (%)
孕酮(ppb) [µg/kg]
圖1：孕酮檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性
%CV
孕酮(ppb) [µg/kg]
圖2：孕酮檢測試劑盒的精密度
由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出孕酮檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)孕酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項(xiàng)】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
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